本期專文要來(lái)跟大家討論的話題是核糖核酸(RNA)的萃取，看到這里各位心中可能已經(jīng)起了疑問(wèn): RNA 萃取不是很簡(jiǎn)單嗎?只要照著標(biāo)準(zhǔn)步驟操作，加一加試劑就完成了，有必要大費(fèi)周章特地開篇幅來(lái)談這件事嗎?其實(shí)越簡(jiǎn)單的東西遇到困難時(shí)就越難解，各位看倌就請(qǐng)耐著性子，聽我們娓娓道來(lái)。

Lab 的經(jīng)驗(yàn)和客戶的難題
以華聯(lián)基因體實(shí)驗(yàn)室的長(zhǎng)期以來(lái)承接客戶RNA檢體的經(jīng)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，我們經(jīng)常遇到的問(wèn)題是(1)RNA的總量不夠，(2)RNA有嚴(yán)重的鹽類污染，(3)RNA有嚴(yán)重的有機(jī)溶劑污染，(4)DNA污染及(5)樣品降解嚴(yán)重(圖一圖二)。前四項(xiàng)問(wèn)題都還好解決，只需要再次萃取或進(jìn)行純化即可解決，但是樣品降解就較為棘手，常常因重新準(zhǔn)備檢體一來(lái)一往，耗掉不少心力和時(shí)間，最后也拿不到好的結(jié)果。
客戶經(jīng)常會(huì)問(wèn)為什么執(zhí)行芯片實(shí)驗(yàn)會(huì)如此要求RNA質(zhì)量呢?而其他的檢測(cè)方法如實(shí)時(shí)定量聚合連鎖反應(yīng)(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction, Q-PCR) 卻不需要?
回答這個(gè)問(wèn)題前就要從實(shí)驗(yàn)的原理說(shuō)起，簡(jiǎn)單的講Q-PCR的檢測(cè)原理是針對(duì)要檢測(cè)的基因，設(shè)計(jì)一對(duì)基因特異性的引子，透過(guò)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)配合PCR的放大方式和及時(shí)偵測(cè)放大的產(chǎn)物量，藉以回推原始的RNA含量；而RT的方式主要是采用隨機(jī)引子(Random_primer)、進(jìn)行互補(bǔ)DNA (cDNA)的翻制，因此即便RNA有些微裂解，作為模板的RNA也可以忠實(shí)的被翻制成cDNA。但是芯片實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，主要是以放大和訊息RNA(mRNA)完全配對(duì)的互補(bǔ)RNA(cRNA) ，再進(jìn)行雜合反應(yīng)，此步驟必須利用poly(dT)- T7啟動(dòng)子序列和訊息RNA的poly(A)結(jié)合后，將T7啟動(dòng)子序列連帶的鑲?cè)敕崔D(zhuǎn)錄的cDNA的5端，再經(jīng)由T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)試管內(nèi)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，生合成反股的cRNA，再進(jìn)行后續(xù)的芯片雜交的實(shí)驗(yàn)?？上攵?，如果RNA有降解嚴(yán)重的現(xiàn)象，表示許多mRNA并不能忠實(shí)的被放大因此會(huì)產(chǎn)生許多偽陰性的結(jié)果。至此讀者心中可能就有一個(gè)概念了，假設(shè)Q-PCR和芯片被應(yīng)用在瞎子摸象的故事情節(jié)中，用Q-PCR的人只要能摸到大象的耳朵就可以說(shuō)這里有大象，透過(guò)計(jì)算耳朵的數(shù)量就可以計(jì)算大象的數(shù)量；但是用芯片實(shí)驗(yàn)方法的人，必須先確認(rèn)所摸到的個(gè)體具備大象的完整特征，才能確確實(shí)實(shí)的說(shuō)這里有一只大象。這也就說(shuō)明了為何芯片實(shí)驗(yàn)會(huì)如此要求RNA的質(zhì)量。

RNA 萃取的方法有哪些？
除了傳統(tǒng)的純化方法，如 LiCl 沉淀等外，因應(yīng)RNA研究的龐大需求，目前市面上已有許多琳瑯滿目的RNA萃取套組，供給不同萃取需求目的之研究，而這些產(chǎn)品的設(shè)計(jì)原理不外乎是利用有機(jī)溶劑進(jìn)行分層萃取如:(1)phenol-chloroform；或利用RNA于酒精中呈現(xiàn)疏水性的特性，進(jìn)行吸附分離如:(2)吸附性管柱 (Silica column)。一般而言，只要有正確的RNA操作觀念配合正確的步驟，大致上都可以萃取出質(zhì)量不錯(cuò)的RNA，但是不同的萃取方法所取得的RNA組成分布會(huì)有所不同，因此建議要根據(jù)所要分析的對(duì)象RNA，選擇正確的萃取方法或套組，例如:如果要研究小RNA的表現(xiàn)就不可選擇以mRNA為萃取對(duì)象的方法。此外，內(nèi)源核醣核酸分解酶(RNase)含量高的樣品，建議使用含phenol-chloroform的裂解液，以增加去除酶活性的能力。以下我就以TRIzol的操作步驟為例，來(lái)跟讀者分享RNA萃取步驟中應(yīng)注意事項(xiàng)及改善萃取RNA值與量的方法。

器具如何清潔？
RNA萃取過(guò)程中，會(huì)面臨的最大的敵人就是RNase，RNase是一個(gè)非常頑強(qiáng)的RNA分解酶，它幾乎無(wú)所不在，在我們所處的環(huán)境中、身體表面甚至細(xì)胞內(nèi)就有內(nèi)源性的RNase存在。RNase展現(xiàn)活性時(shí)不需要輔酶(coenzyme)或輔因子(cofactor)，在變性溶液的環(huán)境下雖然會(huì)失去活性，但是當(dāng)去除變性物質(zhì)后，仍然會(huì)展現(xiàn)些許活性，甚至在低濃度的SDS溶液中仍具有活性，因此能做到有效杜絕去除RNase的污染則RNA的萃取就成功了一半了。因此在操作前的首要工作就是，將所有器械置于180℃的高溫下干烤6小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間;或者以 3% H2O2 浸泡30 分鐘以上，再以滅過(guò)菌的DEPC水沖洗干凈后，用鋁箔包覆滅菌后使用。在操做萃取時(shí)必須于清潔、無(wú)粉塵飛揚(yáng)的環(huán)境，如果環(huán)境允許的話，最好在生物柜或化學(xué)柜中操作。

樣品如何收集/保存？ 
先前我們提及細(xì)胞內(nèi)存在有內(nèi)源性RNase，且其表現(xiàn)量在不同種類的組織中差異極大。例如腦組織和心臟組織擁有相對(duì)低的內(nèi)源性RNase，但是胸腺組織和胰臟組織則保有約100,000倍于腦組織的內(nèi)源RNase。因此動(dòng)物組織等最好都先用液氮冷凍起來(lái)，再進(jìn)行后續(xù)的處理，不建議直接丟到-80℃冰箱。因?yàn)榧彼倮鋬隹蓛鼋Y(jié)RNase的活性，但-80℃冷凍算是緩慢降溫，仍會(huì)造成部分RNA的降解;如果無(wú)法快速冷凍檢體，也可以采用市售的檢體保存液，亦可達(dá)到不錯(cuò)的效果。

如何進(jìn)行樣品的破碎及均質(zhì)化？
有關(guān)樣品的破碎和均質(zhì)化，這個(gè)步驟的重點(diǎn)應(yīng)該擺在如何讓有機(jī)裂解液快速浸潤(rùn)檢體，phenol-chloroform可以溶解細(xì)胞，連帶的會(huì)造成蛋白變性，因此內(nèi)源性RNase的活性就會(huì)去活化;相反的如果無(wú)法讓細(xì)胞快速裂解使蛋白裸露進(jìn)而變性，則RNase就會(huì)降解RNA，因此如何使不同組織細(xì)胞快速裂解，就是一個(gè)值得思考調(diào)整的課題，也是左右成敗的關(guān)鍵。就檢體類型來(lái)說(shuō)，一般培養(yǎng)細(xì)胞多為單層細(xì)胞不會(huì)遇到這樣的問(wèn)題，萃取較為容易，但是立體的組織進(jìn)行萃取就會(huì)遇到均質(zhì)化不均的問(wèn)題進(jìn)而造成RNA降解。因此低溫的液氮碾磨就是破碎組織最有效的辦法，但是液氮碾磨較為麻煩，如果遇到樣品數(shù)比較多的時(shí)候耗時(shí)費(fèi)功效力不彰，但如果條件允許的話，這仍然是一個(gè)好方法。但考慮效率和速度，均質(zhì)機(jī)就是一個(gè)更好的選擇，但是使用均質(zhì)機(jī)的過(guò)程有幾個(gè)重點(diǎn)必須注意:(1)速度要快，在RNase展現(xiàn)活性前完成細(xì)胞均質(zhì)化，(2) 避免產(chǎn)熱，以免降解 RNA，(3)不要過(guò)度研磨，過(guò)度研磨會(huì)打斷DNA，造成小片段的DNA污染。此外，在均質(zhì)裂解細(xì)胞的過(guò)程中有一個(gè)常被會(huì)忽略的重點(diǎn)，就是一般細(xì)胞和有機(jī)裂解液的比例常被忽略，有些操作者會(huì)認(rèn)為多放一些組織就可以得到大量的RNA，但是沒(méi)意識(shí)到太多的組織和太少的裂解液，造成細(xì)胞無(wú)法完全被裂解，RNase無(wú)法完全被變性，效果反而適得其反，最后RNA嚴(yán)重降解。因此如果反應(yīng)完后均質(zhì)液太過(guò)粘稠無(wú)法分層，就必須再加入裂解液。

樣品的離心分層
在phenol-chloroform的萃取方式中，混合液的離心轉(zhuǎn)數(shù)不可任意調(diào)整，應(yīng)固定于12000g的轉(zhuǎn)數(shù)，以免因沉降系數(shù)改變?cè)斐蔁o(wú)法有效分層。當(dāng)離心完成后可以明顯觀察到檢體分成上面水層及下面有機(jī)層，而我們要的RNA就溶解在上面水層中，體積約有500~600μl左右。此時(shí)建議用小口徑的 100 或 200μl tip將水溶液分段吸取到干凈的1.5ml的離心管中，而在這個(gè)步驟常見的失誤就是:操作的人急于將水層取出而攪動(dòng)原先的分層;或感覺(jué)萃取不易想要多回收一些RNA，于是將水層盡其可能的取出，因而造成吸取到有機(jī)溶液和大量的DNA污染(圖三)，造成后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理上的困擾甚至實(shí)驗(yàn)失敗，因此強(qiáng)烈建議只萃取7~8成的RNA水溶液進(jìn)行下一個(gè)步驟，俗話說(shuō)的好，所謂有失必有得，不必為了一顆樹而放棄整片森林，適時(shí)的取舍可以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。此外一般來(lái)說(shuō)，phenol與水有一定比例的互溶，所以此時(shí)的RNA水溶液中仍有一定的phenol殘留，建議一定要再使用chloroform進(jìn)行一次離心分層去除殘存phenol。

RNA 樣品的沉淀
一般我們會(huì)使用乙醇(水溶液:乙醇=1:2.5)或異丙醇(水溶液:異丙醇=1:1)進(jìn)行RNA沉淀，在效果上并無(wú)明顯差異，但是如果已知RNA的含量是少的，則可以使用乙醇沉淀法，并將檢體置于-80℃冰箱間隔一個(gè)晚上再做離心的動(dòng)作，并配合離心時(shí)間的增加，如此可增加RNA沉淀的回收率。

RNA 樣品的清洗去除鹽類
為了去除RNA沉淀物中的鹽類，我們可以采用70~75%乙醇進(jìn)行洗滌，可能的話盡量讓核酸沉淀懸浮起來(lái)，最好的是使用兩次洗滌，再將離心管放入離心機(jī)中離心，用移液器將殘留的乙醇小心吸掉，稍微抽干或吹干核酸沉淀物使殘存的乙醇揮發(fā)后，再以DEPC水進(jìn)行回溶。

結(jié)語(yǔ)
如果以上所闡訴的部分您都注意到了也改善了，但是仍然不能萃取出好質(zhì)量的RNA，那或許我們就必須檢視我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是否會(huì)導(dǎo)致RNA降解機(jī)制的活化，例如:細(xì)胞正在經(jīng)歷細(xì)胞凋亡或組織壞死的生理反應(yīng);或者處理的藥物會(huì)直接引起RNA降解等，如果是那可能就要作實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)修正或下修對(duì)RNA質(zhì)量的要求。